Práctica 5. Fecundación en equinodermos.

Desarrollo temprano del erizo de mar.

         En los organismos con reproducción sexual el óvulo es fecundado por el espermatozoide formándose el cigoto, a partir del cual se originará el nuevo individuo. La contribución de los gametos masculino y femenino al cigoto es muy diferente; el óvulo aporta tanto su conjunto haploide de cromosomas como un rico citoplasma que posee los requerimientos necesarios para que, al menos, se inicie el desarrollo. El espermatozoide, sin embargo, principalmente aporta su núcleo y escasos componentes citoplasmáticos (centriolos).

          El proceso de fecundación comprende una serie de sucesos que en la mayor parte de los organismos pueden resumirse en:

·    Activación del espermatozoide (capacitación), que ocurre en respuesta a las secreciones del oviducto (fecundación interna) o al contacto con el medio acuoso (fecundación externa).

·     Reacción acrosómica que permite que el espermatozoide se abra paso a través de las distintas cubiertas que posee el óvulo hasta la membrana plasmática.

·       Fusión de las membranas plasmáticas del espermatozoide y del óvulo.

·    Bloqueo de la polispermia para evitar que un mismo óvulo sea fecundado por más de un espermatozoide.

·      Continuación de la meiosis en caso de que el óvulo expulsado del ovario se encuentre detenido en alguna de las fases del proceso meiótico (en humanos se encuentra en metafase II, mientras que en equinodermos ya ha finalizado la meiosis).

·      Fusión de los pronúcleos, formándose un núcleo diploide de fecundación, o bien los cromosomas maternos y paternos se ordenan directamente sobre la placa ecuatorial en la primera división de segmentación.

·    Activación metabólica del huevo y comienzo del desarrollo.

        Los equinodermos se usan habitualmente en estudios de biología del desarrollo ya que sus gametos se obtienen en grandes cantidades, pueden ser inseminados fácilmente in vitro (en medio acuoso donde la fecundación ocurre de forma natural) y también son sencillos de mantener en el laboratorio. Además, la fecundación en equinodermos y en mamíferos tiene muchos puntos en común.

    Tras la fecundación comienza el proceso de segmentación. En equinodermos se habla de una segmentación holoblástica radial, esto es, todo el embrión se divide y los planos de división son perpendiculares unos a otros. Las dos primeras divisiones del cigoto y los blastómeros son meridionales, si bien perpendiculares entre sí, lo cual significa que el surco de división se forma desde el polo animal al polo vegetativo del embrión. La tercera división, en cambio, es perpendicular a las dos anteriores, ecuatorial, determinando un embrión de ocho células de idéntico tamaño. A partir de este momento, las subsiguientes divisiones originarán blastómeros de diferente tamaño, definiéndose éstos como macrómeros, mesómeros y micrómeros, cuya disposición en relación a los polos del embrión determinará finalmente el destino de dichas células y la posterior formación de las tres hojas embrionarias principales: endodermo, ectodermo y mesodermo, respectivamente.

Figura 1. Desarrollo temprano del erizo de mar. A.- Cigoto. Obsérvese la membrana de fecundación. B.- Embrión de dos células. C.- Embrión de cuatro células. D.- Embrión de dieciséis células.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

         La práctica consistirá en estudiar el proceso de fecundación y primeras etapas del desarrollo embrionario en erizo de mar. Para ello, en primer lugar se obtendrán los gametos, a continuación se procederá a realizar el proceso de fecundación y finalmente se analizarán los procesos de segmentación y gastrulación.

1.- Obtención de gametos

-         Inyectar a través de la membrana oral (peristoma, zona oral) 1 ml de 0,5 M de KCl en agua de mar (Figura 2.B).

-         Colocar el espécimen sobre un recipiente de vidrio que contiene unos ml de agua salina sobre la cara aboral, lado puesto a la zona oral.

-         Pocos minutos después aparece un líquido espeso en la cara aboral, donde se localizan los gonadoporos. Si el líquido es blanquecino se trata de esperma, mientras que si es rojizo corresponde a óvulos (no existe forma alguna de distinguir los sexos por caracteres externos) (Figura 2.C y 2.D).

-         Observar al microscopio en vidrios de reloj el aspecto y movimiento de óvulos y espermatozoides recién eyaculados y después de diluir con agua (1:10). Los espermatozoides sólo adquieren movilidad después de contactar con el agua salina.

IMPORTANTE: NO UTILIZAR EL MISMO MATERIAL DE VIDRIO PARA ÓVULOS Y ESPERMATOZOIDES.

        Los óvulos se conservan en el frigorífico por espacio de unas pocas horas. Los espermatozoides se pueden mantener hasta 24 h en seco y sin diluir en agua.

Figura 2. Extracción de gametos del erizo. A.- Espécimen sobre la placa de Petri. B.- Inyección de solución salina a través de la membrana oral. C.- A los pocos minutos comienza a observarse la expulsión de gametos. D.- El volumen de la extracción es considerable. El color blanquecino nos indica que en este caso se trata de un macho.

2.- Fecundación

-         Colocar sobre un porta excavado una gota de agua con ovocitos (1 gota de suspensión + 5 ml de agua).

-         Enfocar en el microscopio con cuidado de que el objetivo no entre en contacto con el agua salina.

-         Añadir una gota de esperma (1 gota de semen “seco” + 10 ml de agua).

-         Remover y observar la progresión de los espermatozoides en dirección a los óvulos.

-         Observar la membrana de fecundación que se forma en menos de 5 min.

3.- Desarrollo

    Observar en el microscopio los principales cambios morfológicos que suceden después de la fecundación y que llevan a la formación de la larva Pluteus.

- 5 min                  Membrana de fecundación

- 1 h                      1ª División de segmentación

- 2 h 30 min           Embrión de 16 células

- 6-12 h                 Blástula

- 24 h                    Gástrula

- 48 h                    Larva Pluteus

 

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