PRÁCTICA 2. fotosíntesis: EXTRACCIÓN, SEPARACIÓN Y CUANTIFICACIÓN DE PIGMENTOS VEGETALES Y medida del desprendimiento FOTOSINTÉTICO DE OXÍGENO

 

El estudio de los compuestos biológicos implica su extracción y separación del material (célula, tejido, órgano, etc.) en que se encuentren. Uno de los abordajes más utilizados para este propósito consiste en el uso de técnicas de cromatografía (proceso de separación de mezclas complejas mediante particiones entre una fase fluida móvil y una fase estacionaria). Otra técnica es la de separación por reparto entre disolventes inmiscible, que permite separar una mezcla de sustancias en función de su solubilidad en distintos compuestos inmiscibles.

            Como aplicación de estas dos técnicas, en el desarrollo de esta práctica se extraerán 4 tipos de pigmentos vegetales: clorofilas a y b, carotenos y xantofilas. Todos ellos tienen carácter apolar, qunque su graod de polaridad varía en función de su composición química. De esta forma, existe un gradiente de polaridad desde el más apolar al menos apolar.

 

 

            Esta propiedad permite su separación, y su distinto color su identificación. Su color permite también su cuantificación por técnicas expectrofotométricas.

            Finalmente, mediante métodos polarográficos, con la ayuda de un oxímetro (electrodo de oxígeno), se medirá el desprendimiento fotosintético de O2 en un cultivo de cianobacterias (microalgas verde-azuladas).

 

1.- Separación por reparto en disolventes inmiscibles

 

            Los pigmentos vegetales se extraerán en medio líquido (etanol) con calor, y se separarán utilizando disolventes inmiscibles de distinto grado de polaridad.

 

            Práctica

 

            En las mesas hojas de espinaca, distintos disolventes y embudos de decantación para separar fases inmiscibles.

 

Método:

1.      Extracción: trocear la hoja de espinaca. Introducir los trozos en un tubo de ensayo de calibre grueso y añadir 10 mL de etanol. Taparlo con algodón y calentarlo al baño ‘María’ durante aproximadamente 5 min (retirarlo cuando el etanol adquiera un color verde intenso). Verter el etanol con los pigmentos disueltos en otro tubo de ensayo.

  1. Separación:

-         Añadir al embudo de cdecantación (con la llave cerrada) 5 mL de gasolina.

-         Tomar 5 mL de extracto de pigmentos y añadirlos sobre el embudo de decantación. Se formarán dos fases (A y B)

 

 

-         Añadir 2 mL de agua (o más, hasta que la fase inferior quede sin pigmentos).

-         Desechar la fase inferior (B).

-         Añadir en el embudo 3 mL de metanol 92% (v/v). Se formarán dos fases (C y D).

 

-         Recoger ambas fases en sendos tubos de ensayo (usar un tubo de ensayo largo para la fase C)

-         Añadir al tubo con la fase C 2 mL de KOH-metanólica 30% (p/v) y agitar bien durante 2 min. Se formarán dos fases (E y F).

 

 

                  Cuestiones:

  1. ¿Qué contiene cada una de las fases?¿Por qué esa distribución?
  2. ¿Cómo se separarían los pigmentos de la fase D?

 

2. Cromatografía en papel

 

            Los pigmentos se separarán en base al mismo principio utiolizado en la práctica anterior, con la diferencia de que en este caso, uno de los disolventes utilizados se mueve sobre un soporte sólido (papel).

 

           

 

 

 

Práctica

 

La fase móvil será un disolvente apolar (mezcla de éter de petróleo/acetona/benceno en proporción 85/10/5). La fase estacionaria, de naturaleza polar, será el agua adcorbida en el papel de celulosa utilizado como soporte.

La fase móvil ascenderá por el papel sin mezclarse con el agua, al tiempo que los pigmentos se irán separando en función de su polaridad. Los pigmentos más polares se retendrán más en la fase estacionaria, mientras que los más apolares avanzarán más rápido junto con la fase móvil. La movilidad de cada compuesto respecto al frente del disolvente tiene un valor característico, en unas condiciones experimentales determinadas, que se conoce como coeficoente o factor de reparto (Rf).

 


                                                          

Rf = Xp/Xd

                                                           Xp= distancia alcanzada por el pigmento

                                                           Xd= distancia alcanzada por el disolvente         

 

 

 

 

Método

1. Extracción: en el papel de celulosa se dibujan 2 líneas con lápiz. Una a 2 cm de uno de los extremos y otra a 1 cm del otro extremo.

-         cortar una hoja de diente de león en tiras estrechas.

-         sobre la línea situada a 2 cm del papel de celulosa, colocar un trozo de hoja y machacarla sobre una superficie plana con las pinzas. Retirar los restos de hoja y repetir el proceso con todoas las tiras, hasta tener una mancha oscura de pigmentos en el papel.

2. Separación: Tomar un tubo de ensayo seco de calibre grueso y añadir 3 mL de           disolvente.

-         Tomar la tira de papel con la muestra de pigmentos y colgarla del tapón de orcho por el extremo opuesto a la muestra (por encima de la marca de 1 cm).

-         Introducir la tira de papel en el tubo de manera que no toque las paredes y que el disolvente moje el extremo de la tira, pero sin llegar a tocar la muestra.

-         Esperar a que el disolvente ascienda por capilaridad hasta aproximadamente la marca superior del papel.

-         Sacar la tira del tubo, dejar secar y medir el Rf de cada mancha de pigmento que aparezca.

 

Cuestiones

1.      ¿A qué pigmento corresponde cada mancha y cuáles son sus Rf?

2.      ¿Qué factores pueden afectar al Rf?

 

3. Cuantificación de clorofila a

 

            Los pigmentos fotosintéticos tienen capacidad de absorber distintas longitudes de onda dentro del espectro de luz blanca. Cada pigmento tendrá un máximo de absorbancia característico en una l determinada. Midiendo en una mezcla la DO a la l  correspondiente a un pigmento determinado, se podrá calcular la cantidad del mismo en dicha mezcla.

           

            Práctica

 

La clorofila a presenta un máximo de absorbancia a 665 nm. Utilizando técnicas espectrofotométricas, se cuantificará la cantidad de clorofila a presente en el extracto de pigmentos de hoja de espinca en etanol obtenido en la primera parte de la práctica. Para ello, se aplicará la fórmula de Marker.

[clorofila a]mg.mL-1 = D.O.665 nm x 13,14

 

Método

  1. Tomar 0.3 mL del extracto etanólico de pigmentos y añadir 2.7 mL de etanol
  2. Medir la DO a 665 nm utilizando etanol como blanco

 

Cuestiones

1.      Calcular la concentración de clorofila a en el extracto inicial de la hoja de espinaca.

2.      ¿Cuántos mg de clorofila a se han extraído de la hoja de espinaca?

3.      ¿Se han extraído todos los pigmentos?

4.      ¿Qué es 13,14 en la fórmula de Marker?

5.      ¿Interfieren el resto de pigmentos en la determinación de clorofila a?

 

4. Medida del desprendimiento de oxígeno fotosintético

 

            Durante la fase fotosintética de fotoabsorción (mal llamada etapa lumínica), ocurre un desprendimiento de O2 gas procedente de la fotolisis del agua en el fotosistema II. La determinación de este oxígeno liberado es una medida del funcionamiento del aparato fotosintético, que se puede relacionar con una mayor o menor actividad fotosintética.

 

            Práctica

            Las cianobacterias o microalgas verde-azuladas son microorganismos de organización procariota que realizan fotosíntesis oxigénica muy similar a la de las plantas. En la mesa hay un cultivo líquido de la cianobacteria Anabaena PCC 7120. Al iluminar el cultivo, Anabaena producirá oxígeno procedente de la fotolisis del agua. Este oxígeno se disolverá en agua. Con la ayuda de un electrodo específico, se detectará el aumento de oxígeno disuelto en el medio de cultivo, lo que dará una medida de la actividad fotosintética.

Método

  1. Introducir el electrodo del oxímetro en el cultivo de Anabaena PCC 7120, de forma que esté sumergido en el medio líquido pero no toque el fondo del matraz.
  2. Sellar la boca del matraz con papel Parafilm, para que no escape el oxígeno.
  3. Poner en agitación el cultivo con el electrodo.
  4. Anotar la medida del oxímetro (mg O2 L-1) cada 30 sg. y durante 3 min.

 

Cuestiones

1.      Calcular la velocidad de desprendimiento de oxígeno del cultivo de Anabaena (mg O2. L-1 h)