PRÁCTICA 3. ESTRUCTURA Y MANEJO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO. OBSERVACIÓN DE CÉLULAS Y PROCESOS CELULARES (MITOSIS)

 

El objetivo fundamental de esta práctica es la familiarización con el manejo del microscopio óptico. se utilizará un microscopio compuesto o lumínico, en el que la luz atraviesa la muestra con el material a observar y, a través de un juego de lentes, llega al ojo del observador una imagen aumentada. En la primera parte de la práctica se revisa brevemente la estructura del microscopio y se aprende a enfocar una preparación y las normas para el correcto uso del aparato. En segundo lugar, se realizarán preparaciones sencillas para observar distintas estructuras biológicas de tejidos tanto animales como vegetales. Finalmente, se realizará una preparación algo más compleja que permitirá la observación del proceso de mitosis en meristemos vegetales.

 

1.      Estructura y manejo del microscopio óptico

 

Las partes esenciales que componen un microscopio óptico (ver figura adjunta) son:

 

Parte mecánica

-         Pie o soporte: sirve como base al microscopio y en él se encuentra la fuente de iluminación.

-         Platina: superficie sobre la que se colocan las preparaciones. En el centro se encuentra un orificio que permite el paso de la luz. Sobre la platina hay un sistema de pinza o similar, para sujetar el portaobjetos con la preparación, y unas escalas que ayudan a conocer qué parte de la muestra se está observando. La platina presenta 2 tornillos, generalmente situados en la parte inferior de la misma, que permiten desplazar la preparación sobre la platina, en sentido longitudinal y transversal respectivamente.

-         Tubo: cilindro hueco que forma el cuerpo del microscopio. Constituye el soporte de oculares y objetivos.

-         Revólver portaobjetivos: estructura giratoria que contiene los objetivos.

-         Brazo o asa: une el tubo a la platina. Lugar por el que se debe tomat el microscopio para trasladarlo de lugar.

-         Tornillo macrométrico o de enfoque grosero: sirve para obtener un primer enfoque de la muestra al utilizrse el objetivo de menor aumento. Desplaza la platina verticalmente de forma perceptible.

-         Tornillo micrométrico o de enfoque fino: sirve para un enfoque precidso de la muestra, una vez que se ha realizado el enfoque con el macrométrico. También desplaza verticalmente la platina, pero de forma prácticamente imperceptible. Es el único tornillo de enfoque que se utiliza, una vez realizado el primer enfoque, al ir cambiando a objetivos de mayor aumento.

 

Parte óptica

-         Oculares: son los sistemas de lentes más cercanos al ojo del observador, situados en la parte superior del microscopio. Son cilindros huecos provistos de lentes convergentes cuyo aumento se reseña en la parte superior de los mismos (normalmente 10X en los microscopios que se utilizarán en esta práctica). Dependiendo de que exista uno o dos oculares, los microscopios pueden se mono o binoculares.

-         Objetivos: son sistemas de lentes convergentes que se acoplan en la parte inferior del tubo, mediante el revólver. En esta estructura se pueden acoplar varios objetivos (ordenados de forma creciente según sus aumentos, en el sentido de las agujas el reloj). Un anillo coloreado es distintivo de los aumentos de cada objetivo, que también van reseñados en el lateral del mismo. Algunos objetivos no enfocan bien la preparación al aire, y se deben de utilizar con un aceite de inmersión (normalmente van marcados con un anillo rojo). Estos objetivos de inmersión no se utilizarán normalmente en estas prácticas.

-         Condensador: sistema de lentes convergentes que capta los rayos de luz y los concentra sobre la preparación, de manera que proporciona mayor o menos contraste. Se regula en altura mediante un tornillo (letra J de la figura).

-         Fuente de iluminación: en los microscopios a utilizar, el aparato de iluminación está constituido por una lámpara halógena de bajo voltaje (12V) situada en el pie del microscopio. La luz procedente de la bombilla pasa por un reflector que envía los rayos luminosos hacia la platina.

-          Diafragma o iris: sobre el reflector de la fuente de iluminación. Abriéndolo o cerrándolo permite graduar la intensidad de la luz.

-         Transformador: ya que el voltaje de la bombilla es menor que el de la red, es necesario para enchufar el microscopio. Algunos modelos ya lo llevan incorporado en el pie del microscopio. Además, el transformador dispone de un potenciómetro para regular la intensidad de la luz.

 

1.1.  Montaje y enfoque de una preparación microscópica

 

Antes de observar la preparación al microscopio, esta debe de ser montada sobre vidrio. Para ello existen dos piezas de vidrio denominadas portaobjetos (porta), que, como su nombre indica, es el soporte sobre el que va la muestra, y cubreobjetos (cubre) que siempre ha de colocarse sobre la muestra. Una vez colocada la muestra en el porta, se debe añadir una gota de agua, o de la solución acuosa pertinente, antes de colocar el cubre, para evitar interfases agua-aire, que provocan zonas ciegas.

Para enfocar la preparación se ha de seguir de forma minuciosa el protocolo descrito debajo de la figura.

Consejos prácticos

-         En los microscopios que requieren transformador, el enchufe a la red y desenchufe debe hacerse sobre el transformador, y nunca debe desenchufarse el microscopio del transformador.

-         Se debe mantener apagada la luz del microscopio siempre que no se esté utilizando, ya que la vida media de la bombilla es corta.

-         Siempre se debe comenzar el enfoque con el objetivo de menor aumento.

-         Anotar siempre el número de aumentos con el que se observa la preparación. Para calcularlo basta multiplicar el número de aumentos del objetivo por el de los oculares. Hacer esquemas y dibujos de lo observado con cada aumento.

-         Salvo que se indique lo contrario no utilizar nunca el objetivo de inmersión, ya que se requiere un aceite especial sin el que, además de no enfocar bien, existe una gran probabilidad de dañar la lente al rozar con el cubreobjetos.

-         Una vez enfocada, procurar recorrer, con los tornillos de la platina, toda la preparación. EL MICROSCOPIO, ADEMÁS DE UNA GRAN HERRAMIENTA EN BIOLOGÍA, ES UN GRAN JUGUETE PARA DISFRUTAR DE ÉL DESCUBRIENDO EL APASIONANTE MUNDO DE LO PEQUEÑO, para ello, hay que rastrear todo este mundo.    

    
EL MICROSCOPIO ÓPTICO

 

 

A.      OCULARES (A)

B.       REVOLVER (B)

C.       OBJETIVOS (C) (los aumentos en el ext.)

D.      PLATINA (D)

E.       Tornillos para desplazar la preparación sobre la platina en sentido longitudinal y transversal (E)

F.       CONDENSADOR (F)

G.       Tornillo MACROMÉTRICO (G)

H.      Tornillo MICROMÉTRICO (H)

I. DIAFRAGMA IRIS (I)

J.        Tornillo para regular la altura del condensador (J)

K.      INTERRUPTOR (K)

L.       Regulador de la Intensidad de Luz (L)

M.     PINZAS para ajustar la preparación sobre la platina (M)

N.      PIE O SOPORTE (N)

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

ENFOQUE DEL MICROSCOPIO

 

Los pasos a seguir para la perfecta utilización del microscopio son las siguientes:

1.-      Enchufar el microscopio al transformador y éste a la red (NUNCA ENCHUFAR EL MICROSCOPIO DIRÉCTAMENTE A LA RED. SIEMPRE QUE NO SE ESTÉ MIRANDO POR EL MICROSCOPIO HAY QUE APAGAR LA LUZ).

2.-      Colocar la preparación sobre la platina de forma que la estructura a observar quede en el orificio central de la platina.

3.-      Poner el objetivo de menor aumento cuyo amplio campo visual facilita el hallazgo de estructuras importantes.

4.-      Subir la pletina accionando el tornillo macrométrico y mirando la preparación desde fuera hasta alcanzar el tope superior. En ningún caso tocar la preparación con los objetivos.

5.-      Mirando por los oculares, bajar lentamente la platina con el tornillo macrométrico hasta conseguir ver el objeto lo más nítido posible.

6.-      Ajustar el enfoque con el tornillo micrométrico hasta verlo claramente.

7.-      Para observar la preparación a mayores aumentos cambiar de objetivo con un simple giro del revolver (SIN MOVER EN NINGÚN CASO EL TORNILLO MACRO). Las pequeñas varisaciones que observeis en el enfoque se producen al cambiar de objetivo y se corrigen con el micro.

8.-      Para observar otros campos, desplazar la preparación moviendo los tornillos de la platina.


Para cambiar la preparación:

-    Bajar la platina.

-         Colocar el objetivo de menor aumento

-         Quitar la preparación y colocar la siguiente

 

Para desconectar el microscopio, además de los tres pasos anteriores:

 

-         Apagar y desenchufar el transformador de la red

-         Tapar el microscopio con su funda

 

2. Observación de células animales y vegetales

Para comenzar a utulizar el microscopio, se observarán células animales y vegetales, y se estudiarán sus diferencias. Además, se observarán orgánulos celulares, en concreto plastos de células de tubérculo de patata.

 

Práctica 2.1. Observación de células del epitelio de la mucosa bucal

Este epitelio está constituido por células de un contorno irregular, prácticamente incoloras a la luz blanca, por lo que, para su observación es preciso realizar un proceso previo de tinción, en este caso con azul de metileno, que permitirá observar un citoplasma granulado y un núcleo claramente diferenciado.

 

Método

 

1.                  Raspar suavemente la cara interior de la mejilla con un palillo, y depositar el contenido en un portaobjetos extendiéndolo con cuidado.

2.                  Fijar la muestra a la llama para estabilizar las estructuras y adherirla al porta. Para ello, se pasa la cara inferior del porta por encima de la llama brevemente, con cuidado de no quemar las células.

3.                  Añadir 1-2 gotas de azul de metileno sobre las células fijadas y dejar teñir durante 3 minutos.

4.                  Lavar suavemente la preparación para eliminar el exceso de colorante. Para ello, colocar el porta en pendiente bajo el grifo y dejar caer lentamente un chorro fino de agua.

5.                  Secar la parte inferior del porta y colocar un cubreobjetos.

6.                  Observar la preparación

            Práctica 2.2. Observación de células de hoja de lirio

 

            Estas células se caracterizan por poseer forma regular debido a una pared celular muy refringente, por lo que nos es preciso su tinción para observarlas. En una hoja se pueden observar células epidérmicas, de forma hexagonal y gran tamaño, incoloras, entre las que se incrustan las células oclusivas que forman los estomas, mucho más pequeñas, de forma arriñonada y con cloroplastos de color verde brillate en su interior. En un segundo plano, se pueden observar células del mesófilo o del parénquima en empalizada, tejido fotosintético por excelencia, con forma poligonal y con una gran cantidad de cloroplastos de color verde intenso.

 

Método

 

1.      Hacer una incisión transversal superficial con el bisturí en un trozo de hoja de lirio y, tirando de la epidermis, obtener una lámina lo más delgada posible.

2.      Depositar la lámina sobre un portaobjetos, añadir una gota de agua y tapar con un cubreobjetos.

3.      Observar la preparación

 

Cuestiones

 

1.      ¿Qué diferencias se aprecian entre las células animales y vegetales observadas?¿Cuáles pueden ser generalizables?

2.      ¿El azul de metileno es un colorante ácido o básico?¿Por qué?

3.      ¿Qué interferencias aparecen al observar las preparaciones?

           

3. Observación de plastos de células de tubérculo de patata

           

Los plastos son orgánulos típicos de células vegetales. En la parte anterior de la práctica se han observado cloroplastos de células estomáticas y de células parenquimáticas. En este parte se observará la estructura y propiedades de los amiloplastos de patata.

 

           

 

Práctica

 

            Los leucoplastos son orgánulos incoloros, con formas diversas, cuya función es almacenar distintos tipos de sustancias. Concretamente, los amiloplastos de patata, almacenan almidón que se deposita en capas sucesivas, por lo que poseen forma de concha de mejillón, donde se distingue un punto muy refringente en la punta, llamado hilo (donde se acumula mayoritariamente la amilosa), y unos anillos de crecimiento que en conjunto constituyen la loncilla (donde se acumula mayoritariamente la amilopectina). Debido a la presencia de almidón, los amiloplastos se pueden teñir con lugol.

 

Método

 

1.      Raspar suavemente con el bisturí la superficie de un trozo de patata pelada, y extender sobre un portaobjetos una pequeñísima cantidad del raspado.

2.      Añadir una gota de agua y colocar un cubreobjetos.

3.      Observar al microscopio.

Una vez estudiada la estructura de los amiloplastos

4.      Levantar el cubreobjetos y añadir una gota de lugol (diluido 1/10), volver a colocar el cubreobjetos

5.      Observar la preparación

 

Cuestiones

    

1.      ¿Por qué los amiloplastos aparecen libres y no incluidos dentro de una célula?

2.      ¿Por qué en la loncilla hay fundamentalmente amilopectina, mientras que la amilosa está en el hilo interior?

 

4. Observación de procesos de división celular: Mitosis

 

            Mediante el proceso de mitosis, el núcleo de las células eucaróticas se divide, repartiendo de forma equitativa el material genético, previamente duplicado; asímismo, el citoplasma también se dividirá, repartiendo los orgánulos celulares en dos células hijas. Habitualmente, la mitosis se estudia en 5 fases, que tienen su reflejo en la observación al microscopio de células mitóticas. En células que no se encuentran en la fase de mitosis del ciclo celular, células en interfase, se puede observar un núcleo muy definido por su membrana nuclear. Cuando estas células entran en mitosis, las distintas fases se diferencian como:

-         Profase: el material cromosómico se condensa y comienzan a hacerse visibles los cromosomas. La membrana nuclear y los nucleolos se desorganizan, por lo que el material nuclear ocupa gran parte de la célula.

-         Prometafase: los cromosomas están completamente condensados y buscan su ubicación en el plano ecuatorial de la célula.

-         Metafase: los cormosomas están situados en el plano ecuatorial de la célula, formando la placa madre.

-         Anafase: las cromátidas hermanas se separan, migrando un juego hacia cada polo de la célula.

-         Telofase: cada juego de cromosomas, situado en cada polo de la célula se descondesa. Se organiza la membrana nuclear y los nucleolos.

 

Durante el proceso de final de telofase, se puede observar la citocinesis, por estrangulamiento en células animales o por formación de un tabique en células vegetales.

 

      Práctica

 

Se observará el proceso de mitosis en células del meristemo apical de la raíz de ajo. Este tejido está formado por células indiferenciadas que se dividen activamente. Para la observación del proceso, se realizará una tinción previa del material genético, con orceína acética y clorhídrica.

 

Método

 

1.      Fijación y tinción de la muestra

-cortar el extremo apical de la raíz y colocarlo sobre un vidrio de reloj.

- añadir gotas de orceína hasta cubrir la raíz.

- calentar el vidrio de reloj hasta observar vapor blanco. Cuidar que nunca se seque la raíz


- dejar enfriar durante 5 min y repetir la operación.

- dejar enfriar 10 min.

2.      Preparación de la muestra.

- colocar el meristemo teñido sobre un portaobjetos.

- cortar en 5-6 trozos con un bisturí.

- añadir una gota de orceína fresca y colocar un cubreobjetos.

- colocar una almohadilla de papel de filtro sobre el cubre y realizar un aplastamiento para extender las células, presionando fuertemente con el dedo pulgar.

- retirar la almohadilla de papel y observar la preparación.

 

                        Cuestiones

           

1.      ¿Qué porcentaje de células se encuentra en mitosis?

2.      ¿Se observa el huso acromático?¿Por qué?

3.      ¿Qué tipo de colorante es la orceína?