PRÁCTICA 4. Estudio de un caso práctico de contaminación
ambiental: efecto tóxico del cadmio en la cianobacteria Anabaena sp.
PCC7120
Esta práctica integra todos los
conocimientos adquiridos en las prácticas anteriores para analizar el efecto
tóxico del metal pesado cadmio en cultivos de la cianobacteria fijadora de
nitrógeno Anabaena sp. PCC7120.
El Cd es un metal sin función biológica conocida que se encuentra en el
medio natural a concentraciones generalmente muy bajas o no disponible para ser
tomado por la célula (el metal es tóxico cuando se encuentra solubilizado en su
forma iónica Cd2+). Sin embargo, la entrada masiva de Cd a causa de
la actividad humana (industria de pinturas, pilas, electrónica, etc.), o su
solubilización (mobilización) a pH ácido puede originar una alta acumulación en
ecosistemas acuaticos, con efectos tóxicos sobre las poblaciones establecidas
en ellos. Su toxicidad parece estar relacionada con la similitud del Cd2+
con el ion Ca2+, interfiriendo por tanto con este en los procesos
fisiológicos en los que participa dicho catión. Se trabajará con tres cultivos de la
cianobacteria que han sido expuestos durante unas 20 horas a concentraciones crecientes
de Cd: 0 mM (cultivo
control), 5 mM CdCl2 (concentración subletal) y 50 mM CdCl2
(concentración letal); se valorarán una serie de parámetros que
ayuden a determinar de qué manera afecta el metal pesado la fisiología celular
de este organismo fotosintético.
Práctica
Las cianobacterias son organismos
con organización procariótica que realizan fotosntétisis oxigénica. Además,
algunas de ellas, son capaces de fijar nitrógeno atmosférico en aerobiosis,
destacando las cianobacterias filamentosas con heterocistos (célula diferenciada
con gruesas cubiertas y modificaciones metabólicas para conseguir un ambiente
de microaerobiosis, especializada en fijar N2), como Anabaena.
Gracias a estas dos capacidades, tiene gran importancia como colonizadores
iniciales y como productores primarios, contribuyendo enormemente a la
fertilidad de hábitats húmedos.
En la mesa se encuentran tres
matraces con cultivos líquidos de Anabaena PCC7120, rotulados como A, B
y C. Cada mesa trabajará en grupo, distribuyendo el trabajo por parejas. Dos
parejas trabajarán con el cultivo A, dos con el B y dos con el C. Finalmente se
pondrán en común por mesas los resultados obtenidos, con el objeto de conocer
cúal es el cultivo control, el sometido a dosis subletal de Cd o a dosis letal
de dicho contaminante.
- Homogeneizar el cultivo agitando el matraz, tomar 5 mL del cultivo correspondiente para cada pareja en un tubo de centrífuga.
- Equilibrar los tubos por parejas en la balanza. Colocar enfrentados los tubos equilibrados en la centrífuga y centrifugar durante 10 min a velocidad máxima.
-
Retirar el sobrenadante decantando con suavidad los tubos o con ayuda de una
pipeta y resuspender las células en 5 mL de metanol. Marcar los tubos
convenientemente y colocarlos en la nevera durante 1 hora. Durante este hora
se puede continuar con los puntos 2, 3 y 4.
-
Equilibrar los tubos por parejas y centrifugar durante 10 min a velocidad
máxima.
-
Tomar el sobranadante con una pipeta o decantarlo en un tubo de ensayo.
-
Medir en el
sobrenadante la clorofila a, en el espectrofotómetro a 665 nm y calcular la
concentración aplicando la fórmula de Marker. Expresar el dato como
μg clorofila a / mg peso seco
2.
Estudio
estructural. Homogeneizar los cultivos agitando el matraz, tomar una gota de
cada cultivo y realizar sendas preparaciones para observar al microscopio
óptico las diferencias entre los tratamientos. Estimar la longitud de los
filamentos (nº de células por filamento) y la frecuencia de heterocistos (nº de
heterocistos / 100 células vegetativas). Observar también la morfología de
ambos tipos de células.
3.
Determinación
del crecimiento (peso seco del cultivo) utilizando el espectrofotómetro.
Homogeneizar el cultivo agitando el matraz, tomar 5 mL del cultivo
correspondiente para cada pareja y medir su DO a 750 nm, utilizando un blanco
de agua. Calcular el crecimiento del cultivo aplicando la siguiente fórmula
Peso
seco (mg mL-1) = 0.396 x D.O.750nm
4.
Determinación
de la actividad fotosintética de los cultivos mediante el uso del electrodo de
oxígeno. Utilizando el oxímetro, determinar el desprendimiento de oxígeno fotosintético
de cada uno de los cultivos tomando medidas durante 3 min y calcular para cada
cultivo
mg O2
desprendido / mg peso seco x h
y
mg O2
desprendido / mg clorofila a x h
Cuestiones
Al ser esta práctica un compendio de las
anteriores, los distintos grupos realizarán una puesta en común, analizando y
discutiendo los resultados obtenidos para extraer las conclusiones pertinentes
del estudio realizado.