FIJACIÓN BIOLÓGICA DEL NITRÓGENO   Miguel Redondo-Nieto, Ildefonso Bonilla, Luis Bolaños

FIJACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO EN LEGUMINOSAS

 

INICIACIÓN DEL NÓDULO

Señalización entre la planta y Rhizobium

Señalización entre Rhizobium y la planta

Invasión y formación del canal de infección

 

DESARROLLO DEL NÓDULO

El ciclo celular en las plantas

Desarrollo del nódulo indeterminado

Desarrollo del nódulo determinado

 

DIFERENCIACIÓN DEL SIMBIOSOMA

Membrana peribacteroidea

Fluido peribacteroideo

Bacteroide

 

 

 

 

FIJACIÓN BIOLÓGICA DEL NITRÓGENO

 

     La fijación biológica del nitrógeno atmosférico, consistente en la reducción de N2 a NH4+ por la enzima nitrogenasa, es, después de la fotosíntesis, la ruta metabólica más importante para el mantenimiento de la vida en la Biosfera. Curiosamente, este proceso crucial sólo puede ser llevado a cabo por unos pocos grupos de seres vivos, todos ellos procariotas (Sprent J. y Sprent P., 1990).

 

Los microorganismos fijadores de nitrógeno no constituyen un grupo taxonómico homogéneo, la única característica que comparten es la presencia de la enzima nitrogenasa (Zehr J.P. y col., 1998). Dichas bacterias comprenden organismos fototrofos, como bacterias pertenecientes a la familia  Rhodospirillaceae, Clorobiaceae y Cianobacteriae; organismos quimioautotrofos, como bacterias de los géneros Thiobacillus, Xanthobacter y Desulfovibrio y organismos heterotrofos como las bacterias petenecientes a la familia Frankiaceae, al grupo Rhizobiaceae y a los géneros Azotobacter, Enterobacter, Klebsiella y Clostridium (Sprent J. y Sprent P., 1990). Estos organismos pueden realizar la fijación biológica de nitrógeno ya sea independientemente (a excepción de las rizobiáceas) o estableciendo relaciones simbióticas con otros organismos. Son estas formas simbióticas, concretamente las establecidas entre las rizobiáceas y las leguminosas, las que antiguamente eran aprovechadas para la renovación de los suelos mediante la práctica de la rotación de cultivos; hoy en día sin embargo, desde la aparición de la “revolución verde” en agricultura, esta práctica se ha sustituido por la utilización de fertilizantes químicos a pesar del elevado coste energético y ambiental que supone. Para poder disminuir la dependencia a fertilizantes nitrogenados que está adquiriendo la agricultura mundial se han propuesto varias alternativas que abarcan desde la modificación genética de las plantas a la optimización y mejora de la fijación biológica de nitrógeno (Vance C.P., 2001).

 

Dentro de esta última opción el sistema rizobiáceas–leguminosas es el que ha sido estudiado ampliamente y en mayor profundidad. Ya en el siglo XVI Leonhard Fuchsius dibujó leguminosas noduladas (Fuchsius L., 1542) y en el siglo XVII, Malpighi observó nódulos en raíces de judía (Phaseolus vulgaris) y de haba (Vicia faba) (Malpighi M., 1675). No fue sin embargo hasta finales del siglo XIX cuando el botánico ruso Woronin detectó la presencia de bacterias en nódulos de lupino y alisos (Woronin M.S., 1866). Unos años después Frank demostró que en suelos quemados no se producían nódulos (Frank B., 1879) y a continuación Hellriegel y Wilfarth, que son los investigadores reconocidos universalmente como descubridores de la fijación simbiótica, demostraron en varias leguminosas el requerimiento de una infección previa para la formación del nódulo (Hellriegel H. y Wilfarth H., 1888). Posteriormente Beijerinck corroboró la necesidad de una infección bacteriana para la formación del nódulo al infectar plantas de Vicia faba con cultivos puros procedentes de nódulos de dicha leguminosa (Beijerinck M.W., 1888). No obstante, no ha sido hasta en estos últimos 20 años cuando se ha empezado a comprender este sistema íntimamente si bien aún hay algunos puntos del proceso simbiótico que se desconocen.

 

Una de las incógnitas es la influencia de algunos nutrientes especialmente requeridos por el sistema en el establecimiento y desarrollo de la simbiosis, así como en la organogénesis del nódulo. Concretamente se ha observado que la deficiencia de un micronutriente, el boro (B), afecta drásticamente a la nodulación llegando al punto de abortarla (Bolaños L. y col., 1994), aunque no se ha probado la causa última de tan drástico efecto. También se ha sugerido la existencia de una relación entre este micronutriente y un macronutriente como el calcio (Ca2+). En este sentido se ha observado que la relación B–Ca2+ es importante para el mantenimiento estructural de la pared celular (Kobayashi M. y col., 1999), y que juega un papel en el proceso de simbiosis en leguminosas (Carpena R.O. y col., 2000). Nuestras investigaciones van encaminadas precisamente a profundizar en el conocimiento de las consecuencias de la deficiencia del B en distintos pasos de la nodulación y analizar el papel que juega el Ca2+ durante dicha deficiencia, así como la relación existente entre ambos bioelementos a lo largo de todo el proceso de simbiosis. Un segundo objetivo de nuestra investigación en este campo es el estudio del papel de dicha relación B/Ca en condiciones de estrés salino, donde hemos encontrado cómo los suplementos de B y Ca recuperan la fijación simbiótica del nitrógeno, así como el desarrollo y la productividad de plantas noduladas de guisante, muy inhibidas en condiciones salinas.

 

Fijación biológica de nitrógeno en leguminosas

 

Las rizobiaceas son un grupo muy heterogéneo de bacterias que se han dividido en cuatro familias: Rhizobiaceae, Phyllobacteriaceae, Hyphomicrobiaceae y Bradyrhizobiaceae (Madigan M.T. y col. 2000). Dentro de estas familias sólo unos determinados géneros son capaces de efectuar el proceso de fijación de nitrógeno: Rhizobium, Sinorhizobium, Meshorizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium y Allorhizobium. Con el fin de simplificar la lectura nos referiremos a todos estos géneros como Rhizobium.

 

A diferencia de las cianobacterias y las bacterias pertenecientes al género Frankia, las rizobiáceas no pueden generar un ambiente anaerobio o microaerobio en donde poder realizar la fijación de nitrógeno por si mismas. Para llevar a cabo el proceso estas bacterias han de encontrarse en las inmediaciones de plantas de la familia de las fabáceas e interactuar con las mismas, originando una serie de reacciones en la planta que desencadenarán la formación de un órgano mixto nuevo, el nódulo simbiótico, en el cual se proporciona un entorno controlado, así como los nutrientes necesarios para que la bacteria pueda efectuar el proceso de fijación.

 

Antes de llegar a la consecución del nódulo, tanto la planta como la bacteria han de seguir un protocolo, de tal manera que, si cualquiera de ellos incumple alguna de las condiciones establecidas, la formación del nódulo abortará. Dicho protocolo se puede resumir en:

 

1)      Intercambio de señales de naturaleza química entre la planta y el microorganismo.

2)      Activación del ciclo celular en células del córtex e iniciación del nuevo órgano en la planta.

3)      Infección por parte de la bacteria, formación del canal de infección e invasión de los tejidos recién formados.

4)      Diferenciación de la bacteria a forma especializada.

 

Iniciación del nódulo

 

Señalización entre la planta y Rhizobium

 

Se puede definir como rizosfera a la porción de suelo íntimamente asociada a las raíces de plantas en crecimiento con propiedades físicas, químicas y biológicas diferentes a las del resto del suelo y con una estructura extraordinariamente compleja en la que inciden gran número de variables y en la que se establecen multitud de relaciones biológicas. De hecho, las características físico–químicas de dicha región hacen de ella un lugar muy adecuado para el crecimiento de microorganismos (Bazin M.J. y col., 1990), de los cuales los más abundantes son las bacterias, en gran parte propiciado por la presencia de los exudados de la planta ricos, entre otros, en compuestos carbonados. Entre el 10% y el 30% de los fotosintatos de la planta son secretados en los exudados radiculares (Bowen G.D. y Rovira A.D., 1999) abarcando carbohidratos, ácidos orgánicos, vitaminas, aminoácidos y derivados fenólicos. Entre dichos compuestos se encuentran los flavonoides (derivados del 2–fenil–1,4–benzopirona) (Fig. 1) cuya composición va a variar dependiendo de la especie, y que además de ser metabolizados, desencadenan una serie de respuestas específicas en los rizobios circundantes apropiados. Así, algunos de estos flavonoides a concentraciones nanomolar, provocan la quimiotaxis activa de los rizobios hacia la superficie radical (Sánchez F. y col., 1991). En cambio, estos mismos flavonoides a concentración micromolar, activan en Rhizobium a los genes responsables de la nodulación (genes nod).

 

Cuadro de texto: Figura 1. Formula molecular del 2-fenil-1,4-benzopirona. Los radicales R indican los posibles sitios de modificación.
Cada Rhizobium expresa constitutivamente un grupo de factores de transcripción hélice–lazo–hélice de la familia LysR (Schell M.A., 1993) conocidos como NodD cuyo número y regulación va a depender de la especie de Rhizobium, así por ejemplo en Sinorhizobium meliloti hay tres copias de NodD, siendo dos de ellas, NodD1 y NodD2, activadas por flavonoides mientras que NodD3 es activada por SyrM (Symbiotic Regulator), homólogo de NodD que además de regular NodD3 induce la síntesis de exopolisacárido (EPS) independientemente de la presencia de flavonoides (Swanson J.A. y col., 1993). NodD se encuentra normalmente unida a unas regiones de ADN de 49 pb conocidas como “nod boxes”, que se encuentran en las regiones promotoras de muchos genes implicados en la nodulación, sólo se produce la inducción de estos genes cuando NodD se une a sus activadores (Schultze M. y Kondorosi A., 1998). Entre los genes activados por NodD se encuentran los genes nod, que codifican todo un paquete de enzimas encargadas de la producción de los factores Nod. Los factores  Nod  están compuestos por un esqueleto de N–acetil–D–glucosamina unidos por enlaces b–1,4 sintetizado por NodA, NodB y NodC, que presenta una serie de modificaciones dependiendo de la estirpe de Rhizobium y que van a otorgar de cierta especificidad al proceso de nodulación (Spaink H.P., 2000):

 

Cuadro de texto: Figura 2. Modelo esquemático de los factores Nod. Rn: sitios de modificación; n: número variable de moléculas de N-acetil-glucosamina (de 3 a 6).

1)      Variación en el número de monómeros de N–acetil–D–glucosamina, oscilando generalmente entre 3 y 6 unidades.

2)      La presencia o la ausencia de modificaciones en la molécula indicadas como Rn en la figura 2, entre las que podemos destacar la aparición o no de un grupo sulfato en el extremo reductor.

3)      Distintos ácidos grasos pueden ir unidos a la molécula dependiendo de la estirpe rizobiácea. Esta característica hace que a los factores Nod se les conozca también como lipooligoquitinas o, más comúnmente, lipoquitooligosacáridos (LCO en inglés).

4)      La presencia o ausencia de ácidos grasos insaturados a, b especiales.

 

Señalización entre Rhizobium y la planta

 

La mera presencia de los factores Nod en concentraciones del orden 10–12 M es suficiente para que en la planta se produzca la deformación de los pelos radiculares (Lerouge P. y col., 1990; Heidstra R. y col., 1994) pero se necesitan niveles mayores, del orden de 10–7 a 10–9 M para provocar la formación de los pre–canales de infección, la división de las células corticales y la inducción de genes implicados en las fases previas a la nodulación, las nodulinas tempranas  (Truchet G. y col., 1991). Esta elevada sensibilidad a los factores Nod hace suponer que debe existir un mecanismo mediado por receptores aunque aún no se han podido ni determinar el número ni identificarlos, no obstante se han propuesto hipótesis:

 

1)      Modelo de un único receptor (Hirsch A.M., 1992): se propone la existencia de un único receptor cuya actividad va a venir dada por la estructura del factor Nod, el cual se integraría en la membrana celular de la planta a través del grupo acilo.

2)      Modelo de dos receptores (Ardourel M. y col., 1994): con esta hipótesis se plantea la posible presencia de dos receptores, ambos necesarios para iniciar el proceso de nodulación. Uno de los receptores no posee una especificidad muy elevada en el reconocimiento de los factores Nod pero puede inducir la deformación del pelo radicular, la formación del primordio del canal de infección y la división de las células corticales aún en ausencia de la bacteria. El segundo receptor es más específico e induce la formación del canal de infección y del nódulo aunque siempre es necesaria la presencia de la bacteria. Este modelo actualmente es el que va cobrando más fuerza. Así se ha descubierto un posible receptor de factores Nod, que presenta una elevada homología a receptores tirosina quinasa (Endre G. y col., 2002), y que además presenta dominios de unión a otras proteínas. Una de estas proteínas podía ser una proteína G de membrana la cual también es necesaria para la percepción de los factores Nod (Pingret J.L. y col., 1998).

 

Uno de los primeros efectos que se observa tras la percepción del factor Nod en el pelo radicular es la entrada de Ca2+ al citoplasma (Felle H.H. y col., 1998; Cárdenas L. y col., 1999). Ello conduce a la activación de ciertos canales aniónicos que originan la expulsión de Cl y por tanto la despolarización de la membrana del pelo. No se conocen los mecanismos que inducen la entrada de Ca2+, aunque se ha propuesto que podría estar mediado por proteínas G (Pingret J.L. y col., 1998) y mantenido por canales de Ca2+ sensibles a voltaje. Esta entrada de Ca2+, además de servir como mensajero para la inducción de genes y activación de proteínas implicadas en la nodulación, induce una reorganización del citoesqueleto, que contribuye a la deformación del pelo radicular hasta llegar a una forma característica del fenómeno de la nodulación, el “cayado del pastor” (Shepherd’s crook en inglés). Esta estructura generará una pequeña cavidad en donde la bacteria puede crecer y prosperar.

 

Invasión y formación del canal de infección

 

La unión de las bacterias a la superficie de la raíz es un paso preliminar muy importante que precede a la invasión. Fibrillas de celulosa producida por la bacteria pueden ayudar a enredar al rizobio en la superficie mucilaginosa de la raíz, proceso reforzado por la presencia de proteínas dependientes de Ca2+, ricadhesinas, producidas por la bacteria (Smit G. y col., 1989). Es por ello que los polisacáridos y proteínas producidos por Rhizobium pueden jugar un papel importante en la interacción física entre la planta y la bacteria. Así, mutantes que carecen de EPS ni invaden ni forman canales de infección. Aunque aún no se conoce el papel específico del eps en los prolegómenos de la relación entre la planta y la bacteria, sí se ha hipotetizado sobre dichas funciones (Gray J.X. y Rolfe B.G., 1990). Entre otras, el eps podría enmascarar la superficie bacteriana para evitar el desencadenamiento de una respuesta de defensa por parte de la planta, encapsular a la bacteria contra el estrés fisiológico que existe en el canal de infección, identificar a la bacteria ante el receptor de la planta adecuado... Otro factor a considerar es el hecho de que esta matriz extracelular puede formar una estructura gelatinosa en presencia de iones de calcio (Morris V. y col., 1989). Dicha capacidad podría servir para retirar los iones de Ca2+ presentes en el entorno de la pared vegetal, que normalmente son utilizados para estabilizar y organizar a las pectinas recién sintetizadas y, por tanto, debilita esa zona de la pared habilitando así un lugar propicio para la infección. Además, la presencia de un gel de naturaleza tan rígida puede servir a la bacteria como punto de apoyo para entrar en el pelo aprovechando la presión que ejercen las sucesivas divisiones de la bacteria. De este modo se origina una invaginación de la membrana del pelo por la cual las bacterias infectan a la planta (Fig. 3).

 

 

 


Paralelamente y coincidiendo con la entrada de la bacteria en el pelo radicular, en el interior del mismo se produce un trasiego de vesículas que volcarán su contenido en el entorno de la bacteria (Brewin N.J., 1991) formando así los primordios del canal de infección, estructura a través de la cual las bacterias van a discurrir por la planta hasta llegar al nódulo. Las estructuras preinfectivas se inducen por acción de LCOs en leguminosas con nódulos indeterminados (van Brussel A.A.N. y col., 1992), y en algunas con nódulos determinados como Lotus, aunque no en Phaseolus (van Spronsen P.C. y col., 2001; Niwa S. y col., 2001). Más tarde se detallan estos dos tipos de desarrollo del nódulo. La formación del dicho “camino” de infección está dirigida por la planta merced a la deformación del citoesqueleto que induce una invaginación en la vacuola generando los llamados puentes citoplasmáticos (van Brussel A.A.N. y col., 1992) cuya orientación comunica unas células con otras y por los cuales irá creciendo la bacteria. A lo largo de toda la luz del canal existe una matriz glucoproteica cuyos componentes proceden tanto de la planta como de la bacteria (Broughton W.J. y col., 2000). Así, por parte de Rhizobium nos encontramos, entre otros, glúcidos cíclicos, lipopolisacárido (LPS), fundamental para una correcta infección, succinoglucano y EPS, siendo éste último crucial para la iniciación y posterior elongación del canal de infección (Cheng H.P. y Walker G.C., 1998). La planta por su parte, entre los distintos compuestos que liberan las vesículas al canal de infección, aporta arabinogalactanos (o PsENOD5 en guisante) y proteínas ricas en prolina como ENOD12, pero el componente principal es material glucoproteico denominado glucoproteína de matriz (MGP) (VandenBosch K.A. y col., 1989), recientemente identificado como un tipo de extensina (Wisniewski J.P. y col., 2000), que es secretada por las células del pelo radicular y del córtex y que se acumula tanto en el canal de infección como en los espacios intercelulares de células  no infectadas (Rae A.L. y col., 1991). Es una glucoproteína constitutiva cuya expresión en el proceso de infección se ve incrementada y cuya presencia es necesaria para el desarrollo del canal de infección (Rae A.L. y col., 1992). Se la ha relacionado con un mecanismo de defensa de la planta, al observar cómo plantas infectadas con bacterias mutantes en la síntesis de lipopolisacárido (LPS), aumentan su secreción (Perotto S. y col., 1994).

 

Desarrollo del nódulo

 

Dependiendo del sistema simbiótico podemos encontrar dos tipos de nódulos: determinados o indeterminados. Ello va a venir dado por el lugar en donde se induzcan las divisiones mitóticas en la raíz. Así, si se originan en el córtex interno se originan nódulos indeterminados y si lo hacen en el córtex externo nódulos determinados. Ambos tipos de nódulos, además de presentar una estructura anatómica distinta, también difieren en la forma en que se comporta la bacteria dentro del nódulo en formación. A pesar de ello, la inducción del ciclo celular en ambos sistemas sigue la misma regulación.

 

El ciclo celular en las plantas

 

Las células eucariotas discurren por su ciclo vital pasando por una serie de fases que tienen como función la de preparar y controlar el estado de la célula, con el fin de conseguir una división y, sobre todo, de asegurar una transmisión fiable de la dotación génica del organismo:

 

1)      Fase G1: periodo en el que las células llevan a cabo principalmente las tareas de supervivencia cotidiana. Es en esta fase del ciclo cuando las células pueden diferenciarse, entrando entonces en quiescencia o en la fase G0.

2)      Fase S: espacio temporal durante el que se produce la replicación de la dotación génica.

3)      Fase G2: periodo previo a la mitosis y citocinesis en el que la célula además de prepararse para la división pasa por una serie de controles para verificar la fiabilidad de la replicación cromosómica.

4)      Fase M: breve etapa del ciclo celular en la que se produce el reparto de la dotación cromosómica y la división celular. En determinadas ocasiones una célula puede saltarse esta fase originando un aumento en la ploidía celular, encontrándonos entonces un fenómeno de endorreduplicación.

 

Debido a la rigidez de la pared celular el movimiento no juega un papel importante en el desarrollo de la planta, en contraste con los tejidos animales. Por ello, la morfogénesis en las plantas depende de la división celular y expansión celular, apoyados por la capacidad totipotente que presentan las células vegetales para cambiar su destino en respuesta a señales externas (Burssens S. y col., 1998). A diferencia de los animales, en los que la organogénesis ocurre originalmente en el embrión, el crecimiento usual de plantas implica tanto organogénesis embriónica como post–embriónica. El tallo primario y los meristemos apicales de la raíz se forman inicialmente como parte del embrión en desarrollo y generan las células que se dividirán para formar el tallo y la raíz. Pero a lo largo de la vida de las plantas se generan estructuras nuevas como por ejemplo las raíces laterales a partir de células del periciclo, o la formación de nódulos a partir de células del córtex en leguminosas o de células del periciclo en actinorrizas. Por regla general, para la formación de nuevas estructuras se requieren la inducción de nuevos meristemos, lo que implica que células ya diferenciadas, normalmente en la fase quiescente o G0, vuelvan a reentrar en el ciclo celular, fenómeno que salvo en contadas ocasiones no se produce en animales.

 

Generalmente, la regulación del ciclo celular depende de la presencia de dos familias de proteínas, las ciclinas (Cyc) y las quinasas dependientes de ciclinas o CDKs. Proteínas de ambas familias van a aparecer o desaparecer dependiendo de la fase del ciclo en el que se encuentre la célula y regulando la transición a la fase siguiente.

 

Las ciclinas controlan la actividad de las CDKs así como sus substratos y su localización subcelular. Las CycA y CycB se expresan de forma dependiente a la fase del ciclo celular, aunque las CycA empiezan a expresarse en la fase S, tanto ella como CycB presentan un pico de expresión en la transición G2–M (Mészáros T. y col., 2000). La expresión de las CycD sin embargo no depende del ciclo celular, se expresan en presencia de mitógenos, concretamente, estas ciclinas se inducen en momentos precisos durante la reentrada en el ciclo celular y se mantienen inducidas en células en división (Meijer M. y Murray J.A.H., 2000). Las ciclinas se regulan mediante su inducción y por procesos proteolíticos, así CycA y CycB presentan unos dominios denominados "destruction box" que regulan su proteolisis mediante un proceso dependiente de ubiquitina; sin embargo la mayoría de las CycD presentan secuencias PEST (pro, glu, ser, thr) que es una señal para su rápida degradación (Huntley R.P. y Murray J.A.H., 1999).

 

Las CDKs son serin–treonin quinasas específicas cuya actividad es regulada tanto por la asociación con ciclinas como con fenómenos de fosforilación y desfosforilación (Joubès J. y col., 2000). Existen dos grupos, el primero de ellos, PSTAIRE, son CDKs que poseen esta secuencia aminoacídica dentro de un entorno de 16 residuos en un motivo de interacción con ciclinas. Es una familia de CDKs que guardan una gran homología con la CDK cdc2 de Schizosaccharomyces pombe y de ahí reciben su nombre.  El segundo grupo, los CDKs sin PSTAIRE, tienen un motivo distinto en una posición equivalente, PPTALRE o PPTTLRE, y reciben el nombre de clase CDK–b. Además en base a análisis de expresión génica y de homología de secuencias se ha sugerido que existen dos subgrupos (CDK–b1 y CDK–b2). Dichos grupos se encuentran presentes en la transición de la fase S a fase M a pesar de que en otros eucariotas las CDKs PSTAIRE son las únicas responsables de la regulación G2–M. La actividad de las CDKs no sólo requiere la unión a la ciclina sino además la fosforilación en un residuo de treonina en el T–loop por una quinasa activadora de CDKs (CAK). Además las CDKs pueden ser inhibidas mediante la fosforilación en Thr14 y Tyr15 por las quinasas myt1 y wee1. Dichos fosfatos han de ser eliminados por parte de la familia de fosfatasas cdc25 para reactivar a la CDK. Por otro lado en cultivos celulares de tabaco se ha demostrado que en ausencia de citoquinina se bloquea el ciclo celular en G2 (Riou-Khamichi C. y col., 1999) y sólo se reanuda cuando existe otra fuente de cdc25 añadida por medios de genética molecular. Esto demuestra que las citoquininas participan en la desfosforilación de CDKs, aunque en Arabidopsis se ha observado que también regulan la transición G1–S al activar CycD3.

 

Uno de los puntos claves de regulación para la entrada en el ciclo celular es la transición de la fase G1 a la fase S. Implica la participación de proteínas similares al retinoblastoma (Rb), los factores de transcripción E2F y las ciclinas D y sus CDKs correspondientes. Una de estas proteínas, Rb, es muy importante para la regulación del ciclo celular ya que además de unir el factor de transcripción E2F, impidiendo que ejerza su función,  puede inducir la presencia de histonas desacetilasas en los promotores de los genes regulados por E2F provocando la inactivación de los mismos. Cuadro de texto: Figura 4. Modelo especulativo sobre la progresión del ciclo celular en células vegetales extraído de Huntley y Murray (1999). En él se detalla cómo durante la fase G1, las citoquininas y la sacarosa inducen la síntesis de ciclinas D las cuales forman un complejo con CDK-a (Cdc2a), el cual a su vez está inducidos por auxinas. La actividad de este complejo a su vez se encuentra regulada por la acción de CAKs y por inhibidores de CDKs (CKI). El complejo activo es capaz de fosforilar a Rb provocando su liberación del complejo que forma con otras proteínas. Entre ellas se encuentra E2F, un factor de transcripción que cuando no está unido a Rb activa la transcripción de los genes necesarios para la transición a fase S. En la fase S, las CycA forman complejos con CDK-a regulando la evolución del ciclo. En la transición a G2 se induce la síntesis de ciclinas tipo B (CycB) y se activan las CDKs de tipo B. De esta manera, en este momento del ciclo es posible la interacción de tanto CycA como de CycB con CDK-a y CDK-b dirigiendo así la transición a la fase M, previa defosforilación de las CDKs mediante la acción de tirosina-fosfatasas y la unión de Cks1 al complejo recién formado. Por último, una vez finalizada la fase M, se induce la degradación de las ciclinas. 































Esta desactivación del sistema E2F mantiene a la célula en fase G1. No obstante, la recepción de señales externas como las debidas a la presencia de auxinas, citoquininas y sacarosa inducen la activación del complejo CycD y su CDK que van a fosforilar sucesivamente a Rb. Esta hiperfosforilación de Rb, además de provocar su inactivación induce la liberación de E2F el cual activa la transcripción de ciertos genes cuyo producto conduce a la transición a la fase S. Entre dichos genes se encuentran las CycA y CycB que junto con las CDK PSTAIRE van a actuar regulando sobre todo la transición de G2 a M al fosforilar, entre otras moléculas, a las histonas provocando la condensación de la cromatina (Mészáros T. y col., 2000).

Como se ha mencionado anteriormente, en algunas ocasiones el ciclo puede saltarse la fase de mitosis (M), bien porque las células se diferencian en fase G2 en lugar de en fase G1 o bien debido a la acción de ciertas proteínas, como Ccs52 (Cell Cycle Switch) perteneciente a la familia de las proteínas WD–40, que se encarga de dirigir la degradación de los factores mitógenos (Cebolla A. y col., 1999).

 


Cuadro de texto: Figura 5. Esquema de las fases iniciales de la formación del nódulo. (A): inducción del ciclo celular en células del córtex (flecha); (B): progresión y ramificación del canal de infección en las células recién formadas.

 

 

 

 

 

Desarrollo del nódulo indeterminado

Los nódulos indeterminados se dan en plantas como las del género Medicago, Pisum, Trifolium y Vicia. En este tipo de nódulos son las células del córtex interior las que se reintroducen en el ciclo celular, además, tienen la característica de poseer un meristemo permanente, lo que les otorga una forma cilíndrica con simetría radial en la organización de los tejidos. Así en la zona más exterior se hallan las células vacuoladas del córtex, y hacia el interior se encuentran la endodermis y el parénquima, en donde también aparecen los haces vasculares. Todo ello cubre una zona central en donde Rhizobium se alberga y realiza la fijación de nitrógeno, y que será descrita con más detalle posteriormente.

Se ha comprobado que en plantas crecidas en deficiencia de nitrógeno, a las pocas horas de la inoculación se induce la actividad mitótica en las células del córtex interior, debido a la actividad de los factores Nod (Calvert H.E. y col., 1984; Dudley M.E. y col., 1987) (Fig. 5A). Las primeras divisiones se producen en el plano anticlinal originando el primordio del nódulo. Desde el inicio se establece una polaridad en el primordio; así se mantiene la actividad meristemática en el ápice, causando un crecimiento del primordio hacia el exterior, mientras que las capas celulares inferiores se van diferenciando (Foucher F. y Kondorosi E., 2000) (Fig. 5B).

 

Curiosamente el canal de infección nunca atraviesa células en división sino que progresa a través de los puentes citoplasmáticos de células que han quedado bloqueadas en la fase G2 (Foucher F. y Kondorosi E., 2000). Los canales de infección culminan en gotas de infección, de un tamaño que oscila entre los 10 y 25 mm de diámetro, en células diferenciadas de la región subyacente al meristemo nodular, en las que el ciclo celular está bloqueado. Dichas células, por un proceso de endocitosis, van captando las células de Rhizobium del canal de infección, las cuales alcanzan el ambiente endofítico rodeadas por membrana de origen vegetal que recibe el nombre de membrana peribacteroidea (mpb), dando lugar a un nuevo orgánulo denominado simbiosoma (Brewin N.J., 1991). Normalmente, estas células infectadas poseen una dotación cromosómica de 8C, al haber entrado previamente en ciclos de endorreduplicación, en los cuales, como se ha mencionado anteriormente, Ccs52 juega un papel activo y fundamental. Se ha propuesto la existencia de una relación directa entre el tamaño del núcleo o la ploidía del mismo y el volumen final de la célula (Kondorosi E. y col., 2000). De este modo un aumento de la ploidía en la célula incrementa el espacio disponible para albergar el gran número de bacterias que la invaden.

 

Este proceso de invasión y diferenciación define unas regiones dentro del nódulo indeterminado (Hirsch A.M., 1992) (Fig. 6):

 

1)      Zona I o meristemática: en el ápice del nódulo, corresponde a la zona de células en proliferación.

2)      Zona II o de invasión: inmediatamente por debajo de la zona meristemática, es la región en la que se produce la invasión bacteriana a través de los canales de infección. Las células de esta región son más grandes y vacuoladas que las meristemáticas. Los rizobios en esta zona aún poseen una forma cilíndrica y pueden dividirse. Para diferenciarlos se los denomina bacteroides tipo 1.

3)      Zona de prefijación: en esta región las células vegetales, que aún no han finalizado su diferenciación, están repletas de bacteroides de tipo 2 más alargados que los de tipo 1.

4)      Interzona II y III: en esta franja, las células vegetales finalizan su proceso de diferenciación. Las células de esta región presentan numerosos amiloplastos así como tránscritos de leghemoglobina, proteína encargada de regular la presencia del oxígeno en el nódulo. Además nos encontramos bacteroides de tipo 3 los cuales presentan su tamaño final definitivo, así como una heterogeneidad citoplasmática característica.

5)      Zona III o de fijación: región totalmente diferenciada en la que se realiza la fijación de nitrógeno propiamente dicha. Se subdivide en dos regiones: la zona de fijación y la zona ineficiente. En la primera, las gotas de infección han culminado su proceso de diferenciación, resultando en la formación del simbiosoma, compuesto por la membrana vegetal original modificada en su composición y un bacteroide de tipo 4 con una estructura normalmente en forma de “Y” o de “T” y con una heterogeneidad citoplasmática notable, indicativa de su maduración en forma fijadora de nitrógeno. Por otro lado, las células vegetales no presentan tantos amiloplastos, porque posiblemente hayan sido consumidos durante la actividad fijadora de N2. La zona ineficiente está compuesta por células con bacteroides de tipo 5 que presentan un citoplasma homogéneo indicatorio del inicio de la senescencia.

6)      Zona IV o de senescencia: región en la base del nódulo, comprendida por celulas vegetales y bacterianas en degradación y que se incrementa con la edad del mismo.

 

No todas las células procedentes de la zona meristemática son infectadas, sino que se especializan en distintos tipos celulares (Brewin N.J., 1991). Algunas, por ejemplo, en la endodermis del nódulo forman una monocapa de células con una pared altamente suberizada que impermeabiliza a los gases el parénquima central del nódulo. Además, en dicha región existen células pequeñas que aparecen intercaladas entre las células infectadas. Estas células establecen una red que conecta el tejido central del nódulo con los haces vasculares, a través de la cual se transportan los sustratos carbonados a las células infectadas y se distribuyen al resto de la planta los compuestos nitrogenados generados en el nódulo (Scheres B. y col., 1990).

Cuadro de texto: Figura 6. Modelo esquemático de la estructura del nódulo indeterminado y del desarrollo de los simbiosomas. e: epidermis; ce: córtex externo; m: meristemo; ci: córtex interno; v: tejido vascular. 1 2: formación de la gota de infección y gemación de las bacterias; 3: proceso de diferenciación del simbiosoma, fusión de vesículas del aparato de golgi y crecimiento de la bacteria; 4: simbiosomas maduros.































 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Desarrollo del nódulo determinado

 

Este tipo de nódulos es inducido en plantas como las del género Phaseolus, Glycine, Vigna y Lotus, entre otras. A diferencia que en los indeterminados, en esta clase de nódulos no hay un meristemo permanente. Así, su crecimiento se basa en la expansión en vez de en la división celular, razón por la que presentan una morfología esférica en vez de cilíndrica (Hirsch A.M., 1992). La causa de la ausencia de un meristemo permanente la podemos encontrar en el proceso de formación. Se ha comprobado que las primeras divisiones celulares en respuesta a la presencia de Rhizobium son anticlinales y se producen en la hipodermis (Newcomb W. y col., 1979; Rolfe B.G. y Gresshoff P.M., 1988). A continuación, se genera otro foco de división celular en el periciclo. Posteriormente, estos dos meristemos convergen generando el primordio nodular, en el cual podemos encontrarnos células no vacuoladas procedente de las divisiones de la hipodermis conformando el tejido central del nódulo, y células con un elevado grado de vacuolización procedentes de las divisiones en el periciclo, componiendo el parénquima nodular que rodea al tejido central. gran parte de la actividad mitótica en la región central del nódulo se pierde transcurridos 12 a 18 días tras la inoculación (Newcomb W. y col., 1979). Algunas células de este tejido central son invadidas a través de los canales de infección y pueden ser identificadas por su gran tamaño y densidad, debidos a la elevada presencia de simbiosomas en su interior. Estos simbiosomas, a diferencia de los existentes en nódulos indeterminados, pueden presentar más de un bacteroide en su interior. El resto de células, no infectadas, presentan un tamaño inferior y con una elevada vacuolización; además, en soja se ha comprobado que expresan la enzima uricasa encargada de la producción de ureidos que es la forma en la que se distribuyen los compuestos nitrogenados en estas plantas. Por otro lado, en el parénquima se encuentran varias capas de células separadas por exiguos espacios intercelulares y con un elevado contenido de proteínas ricas en prolina en su pared, que pueden contribuir a limitar la difusión del oxígeno al tejido central (Tjepkema J.D. y Yocum C.S., 1974). Sin embargo, el parénquima no tiene únicamente esta función protectora, ya que posiblemente puede participar en la producción de ureidos, al haberse detectado en la zona de contacto con el tejido central células que presentan un elevado número de peroxisomas, así como un gran retículo endoplasmático y la enzima uricasa (Newcomb E.H. y col., 1989).

 

Diferenciación del simbiosoma

 

De forma paralela al desarrollo del nódulo, Rhizobium se distribuye por el mismo a través de los canales de infección, o a través de la división de células previamente infectadas, según se trate de un nódulo indeterminado o determinado, a la par que va sufriendo una serie de modificaciones que culminan en la formación del simbiosoma, el cual presenta una serie de características que son indispensables para realizar la actividad fijadora de nitrógeno.


En un simbiosoma se pueden distinguir los siguientes componentes:

 

1)      Membrana peribacteroidea (mpb)

2)      Fluido peribacteroideo (fpb)

3)      Bacteroide

 

Membrana peribacteroidea

 

Esta envuelta es absolutamente necesaria para la actividad del simbiosoma (Regensburger B. y col., 1986), al servir de intermediario de señales y nutrientes entre la bacteria y la planta. Aunque tiene su origen en la porción de la membrana plasmática vegetal que rodea a Rhizobium durante la invasión, la naturaleza de la mpb madura se asemeja más a la de la membrana del tonoplasto. La razón de este cambio en la composición radica en la fusión de vesículas procedentes tanto del aparato de Golgi como del retículo endoplasmático que conduce al crecimiento de la membrana peribacteroidea. Por otro lado, esas vesículas transportan determinados componentes proteicos, como una H+–ATPasa, que pasan a incorporarse a esta cubierta. La actividad de esta proteína genera una acumulación de H+ en el espacio peribacteroideo, y por tanto un descenso de pH que el bacteroide va a combatir excretando el nitrógeno fijado en forma de amoniaco que en ese ambiente se encontrará ionizado como NH4+ (Fig. 7). Los iones amonio pasan a través de un transportador específico de la mpb al citoplasma de la célula vegetal en donde el sistema GS–GOGAT los incorpora en forma de aminoácidos, amidas o ureidos. Además de un gradiente de pH, se genera un gradiente electroquímico aprovechado por determinados transportadores, como por ejemplo el de malato, con el fin de proporcionar sustratos carbonados al bacteroide.

 

Se ha podido determinar que en el simbiosoma se acumula Ca2+ (Vincent J.M. y Humphrey B.A., 1963) y que además participa en la regulación de protein–quinasas de membrana que controlan el transporte de malato y amonio a través de la mpb.


Fluido peribacteroideo

El fluido peribacteroideo (fpb), definido como el material soluble existente entre la mpb y el bacteroide, mantiene en contacto la superficie de ambos, estableciendo una zona que permite la interacción. Como se ha mencionado anteriormente, es donde se va a acumular una alta concentración de H+ debido a la actividad ATPasa de la mpb (Fig. 7). Además, desde el aparato de Golgi se secretan proteínas al fpb características de lisosomas como proteasas, trehalasas ácidas o manosidasas, que hacen del simbiosoma un orgánulo con propiedades líticas (Mellor R.B., 1989). El equilibrio en el intercambio de metabolitos entre la planta y el microorganismo resulta vital para la simbiosis, de tal forma que, una alteración del mismo producida por alguno de los dos miembros de la asociación, llevaría a una acidificación en el interior del simbiosoma que conduciría a la activación de las hidrolasas y por lo tanto a la muerte del

 

 


simbiosoma y a la senescencia del nódulo.

 

Mediante el uso de técnicas inmunológicas se ha detectado material glucoproteico procedente también de la fusión de vesículas del aparato de Golgi (Perotto S. y col., 1991). A finales de la década pasada, se identificó a uno de los componentes glucoproteicos del fluido como miembro de la familia de las lectinas y se le ha llamado PsNLEC–1 (Dahiya P. y col., 1997). Se ha demostrado que la presencia de estas lectinas está relacionada con la maduración de la bacteria hacia bacteroide, ya que en mutantes de guisante incapaces de glucosilar a estas proteínas los bacteroides detienen su desarrollo en una forma inmadura (Dahiya P. y col., 1998).

 

Bacteroide

 

La diferenciación de los bacteroides fue observada por primera vez por Beijerinck en 1888 (Beijerinck M.W., 1888). Dependiendo del sistema simbiótico, los rizobios al invadir las células del córtex sufren un destino distinto. En nódulos indeterminados las bacterias que se liberan al citoplasma dejan de dividirse poco después de diferenciarse. En el proceso de diferenciación pueden o bien aumentar su tamaño original de cuatro a siete veces, como es el caso de Sinorhizobium meliloti, o bien adquirir un forma de “Y”, como el caso de Rhizobium leguminosarum. En nódulos determinados sin embargo, las células infectadas mantienen momentáneamente la actividad mitótica por lo que las bacterias en el interior de la gota endofítica siguen dividiéndose con el fin de poder mantener su presencia en las células vegetales recién formadas.  Al igual que en nódulos indeterminados las bacterias incrementan su tamaño aunque no cambian de forma.