Universidad Autónoma de Madrid

Principios de la Técnica

 El impacto de cada célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula.

En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo, las células pueden estar vivas o fijadas pero, obligadamente en suspensión celular y en forma de célula única. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz láser mediante un flujo continuo, cada célula, a la vez que dispersa la luz, emite luz fluorescente como consecuencia de la excitación láser a la que es sometida. Los parámetros que típicamente se miden de forma simultánea por cada célula son:

1. Dispersión frontal de la luz a 2⁰ (forward scatter), valor proporcional al tamaño celular.
2. Dispersión de la luz ortogonal (side scatter), proporcional a la cantidad de estructuras granulares o complejidad de la célula.
3. Intensidades de fluorescencia a diferentes longitudes de onda.

Los citómetros de flujo están formados por complejos sistemas fluídicos, ópticos, detectores electrónicos, convertidores analógico-digitales y ordenadores.

• El sistema fluídico permite un enfoque hidrodinámico del flujo celular hasta conseguir el alineamiento de las partículas o células con el láser.
• Los sistemas ópticos permiten el enfoque del haz láser con un diámetro reducido para impactar sobre el menor número de partículas posibles simultáneamente y un sistema de espejos y filtros dirigen las señales producidas por ese impacto del láser sobre una célula para conducirlas hacia unos detectores o fotomultiplicadores.
• El sistema electrónico se encarga de la cuantificación de los destellos de fluorescencia y de la luz dispersada transformándolas en datos electrónicos. El ordenador permite almacenar datos de miles de células por cada muestra y representar los resultados gráficamente. Además de la representación gráfica, el software aporta varios datos estadísticos de las muestras analizadas entre ellos: media, mediana y coeficiente de variación.

Aplicaciones

Las aplicaciones fundamentales de esta técnica se dan en biología molecular, celular y medicina y son la identificación de antígenos celulares mediante técnicas de inmunofluorescencia y el estudio del contenido de ADN y fases del ciclo celular.
La Citometría de flujo se utiliza en biomedicina en los siguientes campos:

- En hematología: contaje celular, fórmula leucocitaria, contaje reticulocitario, análisis de médula ósea.

- En farmacología: estudios de cinética celular.

- En inmunología: Determinación de subpoblaciones linfocitarias, inmunofenotipificación de leucemias y linfomas.

- En oncología: diagnóstico/pronóstico, monitorizar tratamiento.

- En microbiología: diagnóstico bacteriano y vírico, sensibilidad a antibióticos.

- En genética: cariotipo, diagnóstico de portador, diagnóstico prenatal.

En biología celular, la citometría de flujo permite estudiar numerosos parámetros celulares tales como la viabilidad, el metabolismo celular, algunas enzimas, la función mitocondrial y por supuesto expresión protéica y de receptores. Consiguiendo así una caracterización celular amplia en casi cualquier tipo de cultivo celular. El gran número de células analizadas en citometría de flujo en relativamente poco tiempo, permite la obtención de gran cantidad de datos estadísticos que pueden ser usados en gran variedad de estudios y ensayos clínicos.
La Citometría de Flujo tiene varias aplicaciones dentro de otros campos, incluyendo, la biología vegetal y biología marina, en microbiología de los alimentos e incluso en agricultura (estudios de ploidia) y veterinaria (reproducción animal).
También es útil en el estudio de la ecología microbiana, muy importante en estudios medioambientales, a través del seguimiento y la identificación de microrganismos acuáticos y de ambientes extremos.
El tipo de muestras que se pueden analizar en citometría de flujo es muy variado y va desde cultivos celulares, células sanguíneas, células vegetales, e incluso en células extraídas de órganos. Los únicos requisitos serían conseguir una suspensión celular y que el tamaño de cada partícula esté en un rango aproximado de entre 0,5 y 40 µm de diámetro.
Existe un tipo especial de citómetros denominados citómetros sorter que además de analizar consiguen separar físicamente las células de interés (positivas para GFP o para cualquier otro parámetro) y recogerlas en tubos específicos o sobre placas en condiciones de esterilidad, permitiendo incluso su posterior cultivo. 

Tipo ensayo

FACSVantage SE (sorter):

• Inmunofenotipajes celulares: 5 parámetros de fluorescencia.
• Ciclo Celular en células fijadas o vivas, con Yoduro de Propidio.
• Estudios cinéticos de funcionalidad celular.
• Análisis Multiparamétricos funcionales y de expresión génica (GFP o antígenos de superficie).
• Separaciones celulares de alta velocidad con la posibilidad de usar cualquiera de los modos de separación (Enriquecimiento, Pureza o Célula Única) y en condiciones de esterilidad. La separación es posible en diversos tipos celulares como células en suspensión, células adherentes, e incluso bacterias o algas.
• Separación de células sobre cualquier tipo de soporte (portas, placas petri, placas 6, 12, 24, 48, 96 pocillos) incluyendo el clonaje de una única célula.
• Estudios de Micropartículas (0.5, 0.9 µm).

Citómetros analizadores: FC 500 MPL y FACSCANTO II:

• Detección de antígenos de superficie.
• Detección de antígenos intracelulares.
• Ciclo celular con Ioduro de propidio.
• Estudios cinéticos de funcionalidad celular.
• Estudios de prolifereación con CFSE.
• Contaje de algas, bacterias, cianobacterias, etc.
• Análisis Multiparamétricos funcionales y de expresión génica (GFP o antígenos de superficie).
• Estrés oxidativo: DCFH, mitosox, DHE.
• Ensayos de detección de citocinas solubles en sobrenadantes de cultivos.

 

Funcionamiento del Servicio

• Situación:

Laboratorio C-12 (dentro del Departamento de Fisiología, planta baja).

Facultad de Medicina.

C/ Arzobispo Morcillo, 4 (frente al Hospital La Paz-Madrid)

• Es IMPRESCINDIBLE contactar previamente con el Servicio de Citometría para planificar el experimento de Sorting a través del teléfono 914973128 o en la dirección de correo electrónico citometria.sidi@uam.es Para hacer una reserva de horas habrá que hacer una solicitud de ensayo previamente. La página para realizar dicha solicitud se encuentra disponible en la siguiente dirección:@LIMS
• El número asignado a esta solicitud de ensayo es necesario para poder realizar la reserva en un turno concreto. Si no se realiza la solicitud de ensayo NO se podrá reservar en el servicio de citometría.
• Puede consultar las tarifas en la siguiente dirección: TARIFAS. Los convenios establecidos con centros correspondientes a ambas tarifas se regirán por los precios pactados en cada caso concreto. Estas tarifas no incluyen IVA en caso de facturación a organismos externos a la UAM.
• Puede darse de alta en el SIdI en la siguiente dirección: ALTA
• El laboratorio funciona bajo el sistema de gestión de calidad ISO9001.
• Si es necesario asesoramos en el diseño de experimentos para citometría e interpretación de resultados.
• Direcciones de Interés:
• Protocolos de citometría de flujo: PROTOCOLOS I, PROTOCOLOS II.
• Para conocer los espectros de excitación y emisión de tus fluorocromos: ESPECTROS.